DPPH LÀ GÌ

     
Nguyên tắc của phương phápCách pha hóa chấtTiến hành bội nghịch ứngCông thức tính kết quảCác để ý cơ bảnTài liệu tham khảo

NGUYÊN TẮC

Phương pháp xác định kỹ năng bắtgốc thoải mái DPPHᐧ (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) được cách tân và phát triển bởi Blois . So với này dựa vào sự đổi khác màu của hỗn hợp DPPH. DDPH﮲ là nơi bắt đầu tự do bền màu tím, bao gồm điện tử không ghép song trên nguyên tử nito chế tạo thành khối hệ thống liên hợp năng lượng điện tử. Electron tự do thoải mái của phân tử nito trong DDPH﮲ lúc bắt cặp với cội hydro từ chất kháng oxyhóa làm mất đi đi màu sắc tím đặc thù của gốc tự do DDPH﮲ trongdung dịch methanol. Khả năng khử gốc DDPH﮲ của một hóa học kháng oxy hóa thể hiện ở tại mức độ làm bớt màu của dung dịch DDPH, được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở cách sóng λmax = 517 nm. Phụ thuộc đường chuẩn chỉnh xác định quý giá IC50 .

Bạn đang xem: Dpph là gì

Bạn sẽ xem: Dpph là gì

PHA HÓA CHẤT

1.Pha dung dịch DPPH

Cân 0.0056g DPPH hòa trong 5mL Methanol tinh khiết → dung dịch DPPH 30mM (stock 10X), bảo quản nhiệt độ lạnh, bọc kín đáo bằng giấy bạc.

Khi làmthí nghiệm, pha loãng stock 10X → 1X (3mM)

2.Pha mẫu yêu cầu phân tích

Đối với mẫu dạng rắn (cao chiết/ bột):

-Xác định dung môi để hòa tan mẫu. Lấymột không nhiều mẫu, hòa trong số dung môi khác biệt (nước, methanol, ethanol, acetone,DMSO,… ). Quan tiếp giáp lựa chọn dung môi nào có công dụng hòa tan trọn vẹn mẫu cầnphân tích. Nếu sẽ biết mẫu của mình hòa tan trong chất nào rồi, các bạn có thểbỏ qua cách này.

-Hòa chảy 1000 ug mẫu mã vào 1 mL dung môi, nhận được dung dịch có nồng độ 1000ppm.

-Pha loãng bậc 2 liên tiếp (two-foldserial dilution) thành dãy những nồng độ khác nhau và dừng ở khoảng chừng nồng độ trường đoản cú 5 –10 ppm.

Đối vớimẫu so với dạng lỏng (dịch chiết):

-Định lượng chất cần phân tích trongdịch phân tách và tùy thuộc vào chất của chúng ta là các loại hợp chất gì, sẽ sở hữu những phươngpháp định lượng không giống nhau. Ví dụ, các bạn có dịch phân tách từ bắp cải tím và muốn phântích hoạt tính của hợp chất anthocyanin vào dịch chiết, bạn thực hiện phươngpháp “pH Vi Sai” để xác định dịch chiết ban sơ có hàm lượng anthocyanin là baonhiêu ppm.

-Từ dịch tách ban đầu, trộn loãng bậc2 tiếp tục (two-fold serial dilution) thành dãy các dịch phân tách ở độ trộn loãngkhác nhau (nên làm từ 7 – 10 lần pha loãng). Ở bước này, áp dụng dung môi táchchiết mẫu để pha loãng mẫu.

-Từ lượng chất chất có trong dịch chiếtban đầu, xác minh hàm lượng chất nên phân tích vào dịch chiết ở mỗi bậc phaloãng.

3.Pha đối chứng

Nếu thực hiện đối bệnh dương là vitamin C, pha dãy nồng độ từ bỏ 0 → 30 ppm, áp dụng dung môi là nước(Vitamin C tan xuất sắc trong nước)

Nếu sử dụng các đối chứng khác, cân 100 ug hóa học đối hội chứng và hòatan vào dung môi, sau đó pha loãng bậc 2 về khoảng tầm nồng độ 0 – 5 ppm.

TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG

Trong một giếng của đĩa 96 thêm lần lượt những thành phần sau:

·100 μl chủng loại phân tích/đối chứng/dung môi

·100 μl DPPH 3 mm / methanol

→ bội phản ứng nửa tiếng trong tối, đo mật độ quang tại cách sóng 750nm

Bảng bố trí thí nghiệm

Mẫu phân tích

Mẫu trắng

Mẫu đối bệnh dương

Mẫu đối chứng âm

Dung dịch DPPH

x

x

x

Mẫu phân tích

x

x

Chứng dương (Vitamin C)

x

Methanol

x

Dung môi

x

CÔNG THỨC TÍNH

Phần trăm gốc tựdo DDPH﮲ được tínhtheo công thức:


*

Chú thích

SCDPPH﮲ : năng lực bắt gốctự bởi DDPH﮲ (%)As : Độ hấp phụ quang của mẫu phân tíchAb : Độ hấp thu quang của mẫu trắngAn : Độ hấp thu của mẫu đối hội chứng âm

Tính quý hiếm IC50 của chủng loại thử và chủng loại đối chứng dựa vào phương trình con đường tính thân nồng độ với % hoạt tính bắt gốc tự do của chúng, theo công thức sau:


*

Chú thích

IC50 : Nồng độ mẫu thử, chuẩn chỉnh có thể bắt được 50% gốc tự do thoải mái DDPH﮲a, b : thứu tự là độ dốc cùng hệ chắn của phương trình tuyến tính duy trì nồng độ với % bắt nơi bắt đầu tự do.

Mẫu được thựchiện lặp lại ba lần và kết quả được màn biểu diễn dưới dạng quý giá trung bình ±SD

LƯU Ý

Có thể trộn tùy ý nồngđộ DPPHᐧ, chỉ cầnđảm bảogốcDPPHᐧ trong bội phản ứng luôn dư. Tuy nhiên vậy, mình không khuyến khích các bạn pha dung dịch DPPH ởnồngđộ quá cao, bởi vì lúc nàymàu của hỗn hợp DPPH siêu đậm, gồm thểkhó quan giáp sự thayđổi của màu sắc trước với sau phản ứng trong một vài trường hợp.

Xem thêm: Cắt Tóc Đẹp Cho Bé Trai - Top 10 Kiểu Tóc Đẹp Cho Bé Trai Dễ Thương 1

Dung dịch DPPH nhạy bén với ánh sáng, dễ bị oxy hóa, bởi vì vậy chúng ta không yêu cầu pha quá nhiều, giả dụ pha dư có thể bảo vệ ở ánh nắng mặt trời lạnh với bọc kín đáo giấy bội bạc để kiêng ánh sáng, và sử dụng sau 1-2 ngày, không nên dùng lúc đã quá lâu hoặc quan gần cạnh thấy màu sắc nhạt đi so với ban đầu.

Mẫu đối triệu chứng âm là mẫu mã quan trọng, các bạn nên tái diễn nhiều lần chủng loại này vào một mẻ thí điểm (trên 3 lần) để hoàn toàn có thể có số liệu đúng mực nhất.

Mẫu trắng cần thiết trong trường hợp hóa học phân tích của khách hàng có màu, đặc biệt là những hóa học có màu sắc gần như thể với màu sắc của dung dịch DPPH (anthocyanin, astaxanthin,... ). Đối với ngôi trường hợp chủng loại không màu với trong suốt, các chúng ta cũng có thể bỏ qua mẫu mã trắng.

Mẫu phân tích cần phải hòa tan trả toàn, trường hợp là dịch phân tách thì dịch phân tách cần đồng hóa và không có cặn bẩn. Nếu cần thiết, các chúng ta có thể sử dụng filter 0.45 um để lọc mẫu trước lúc phân tích.

Dung dịch sau phản ứng để đo OD phải đồng nhất, không có bọt khí (dễ xẩy ra khi làm mẫu vitamin C). Trong trường vừa lòng này có thể dùng đầu tip hoặc tăm để khuấy nhẹ, loại bỏ bọt khí.

Khi thêm những thành phần bội phản ứng vào đĩa 96 hoặc ống nghiệm, hỗn hợp DPPH cần phải thêm sau cùng, và bảo đảm an toàn tránh tia nắng nhiều nhất tất cả thể. Đối với đĩa 96 các bạn cũng có thể cố gắng làm việc nhanh. Đối cùng với ống nghiệm, các bạn có thể bọc lại bởi giấy bạc. Nhằm phản ứng ra mắt ở nới không tồn tại ánh sáng. Sau thời hạn phản ứng, tác dụng cần được đo ngay, không để lâu bên cạnh ánh sáng.

Phần kết quả, các chúng ta có thể nhập vào excel với tính toán thủ công bằng tay theo công thức mình đã trình bày, hoặc hoàn toàn có thể sử dụng một số phần mềm thông dụng để sở hữu được tác dụng nhanh rộng nhé. Ở đây, mình đề xuất 1 phần mềm thân quen là Graphpad Prism.

Xem thêm: Kiểm Điểm Cá Nhân Năm 2021 9 Mẫu Bản Kiểm Điểm Đảng Viên Mới Nhất

THAM KHẢO

2.Kedare SB, Singh R. Genesis và development of DPPH method of antioxidantassay. Journal of food science và technology. 2011;48(4):412-422.